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本试剂盒基于硫代巴比妥酸法用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液等样本中的MDA进行定量检测，广泛用于脂质氧化(lipid peroxidation)水平检测。

动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物，此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标，生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA，例如thromboxane synthase也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。

丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应形成红色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在535nm处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。另外MDA-TBA加合物也可以在535nm被激发产生最大发射波长553nm，据此也可以进行荧光检测。

组分	规格	保存
TBA	100mg	RT避光
TBA稀释液	10mL	RT
抗氧化剂	0.5mL	-20℃避光
MDA标准品(1mmol/L)	0.2mL	-20℃避光
MDA检测液	9mL	RT
MDA分离液	25mL	RT

保存：按标签指示条件保存，有效期1年。

• 离心机、离心管、96孔板、酶标仪或分光光度计、水浴锅或恒温箱
  
• 生理盐水或PBS

• 上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。
  
• 参考取样量：血清、血浆、尿液取100μL；低密度脂蛋白悬液取100～200μL；食用油取30μL；肝脏、心肌、肌肉等，取5%或10%匀浆100～200μL。
  
• 测定样品吸光度值较低时，可将水浴延长至80min，但应同时延长，以免造成批间差异。
  
• 待测样本如不能及时测定，应置于-20℃保存，4天内稳定。
  
• 避免使用EDTA、枸橼酸、氟化钠、草酸等抗凝剂。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

• 准备样品：
  
  • 血清、血浆、尿液、脑脊液样品：从待测样本中分离出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围，用生理盐水或PBS稀释后检测。
    
  • 组织、细胞等样品：组织或细胞可以使用PBS或RAPI裂解液等进行匀浆或裂解，匀浆或裂解组织时组织重量占匀浆液或裂解液的比例应为10%；对于细胞，每10⁶个细胞使用0.1mL裂解液或匀浆液，匀浆或裂解后离心10min，取上清用于后续测定。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃条件下进行操作，样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内MDA含量。
    
  • 该试剂盒对于样品中的常见化学成分的兼容性参考下表：
    

    试剂类别	化学成分	是否干扰
    缓冲液	HEPES (100mM)	否
    	Borate (50mM)	否
    	Phosphate (100mM)	否
    	Tris (25mM)	否
    去垢剂	CHAPS (≤1%)	否
    	Triton X-100 (≤1%)	否
    	Tween 20 (≤1%)	否
    抑制剂/螯合剂	PMSF (≤200μM)	否
    	EDTA (≤1mM)	否
    	EGTA (≤1mM)	否
    	Antipain (≤100μg/mL)	否
    	Chymostatin (≤10μg/mL)	否
    	Leupeptin (≤10μg/mL)	否
    	Trypsin (≤10μg/mL)	否
    其他	Glycerol (≤10%)	否
    	Sucrose (250mM)	是

• 配制TBA工作液：称取适量TBA，用TBA稀释液配制成浓度为0.68％的TBA工作液；例如取34mg TBA用5mL TBA稀释液配制，最终浓度即为0.68%的TBA工作液，TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加热到60℃促溶，并可通过反复剧烈Vortex促溶。
  
• 稀释系列标准品：取适量MDA标准品(1mmol/L)，用恰当溶液稀释至1、2、5、10、20μM。
  
  • 如果进行简易快速检测，标准品直接稀释10μM。
    
  • 待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释。
    
  • 待测样品由匀浆液、裂解液、PBS获得时，标准品宜用相同溶液稀释，其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性。
    
  • 配制好的MDA标准品4℃避光保存，至少3个月内有效。
• 配制MDA检测工作液：临检测前，根据待测定的样品数(含对照)，参考下表新鲜配制适量的MDA检测工作液。
  

  检测次数	1次	10次	20次
  TBA工作液	75μL	750μL	1500μL
  抗氧化剂	3.1μL	31μL	62μL
  MDA检测液	7.5μL	75μL	150μL
  MDA分离液	225μL	2250μL	4500μL
  总体积	310.6μL	3106μL	6212μL

• MDA加样：在离心管或其它适当容器内加入8μL适当溶液作为空白对照(待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS获得时，标准品宜用相同溶液稀释，其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性)，加入8μL上述不同浓度标准品用于制作标准曲线(如果进行简易快速检测，直接加入浓度为10μM的标准品)，加入8μL样品用于测定；随后加入300μL MDA检测工作液。可参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：
  

  加入物质(μL)	空白管	标准管	测定管
  匀浆液、裂解液、PBS、生理盐水等	8	－	－
  标准品	－	8	－
  待测样品	－	－	8
  MDA检测工作液	300	300	300

  混匀，加盖，95℃水浴煮沸，加热时务必注意避免液体暴沸溅出；如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管或用Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔；最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热金属浴。
  
• MDA测定：水浴或流水冷却至室温，离心，取上清，其颜色为黄色至棕红色，蒸馏水调零，酶标仪测定535nm处吸光度，如果不方便也可以测定530～540nm之间的吸光度，分别记为A _空白、A _标准、A _测定。

如果进行简易快速检测，直接以10μM标准品进行计算，获得MDA的摩尔浓度；如果需要精确计算，以MDA标准品浓度为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据标准曲线计算处MDA提取液的浓度；对于固体状组织，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，例如μmol/g蛋白或组织。
简易快速血清、血浆、尿液等液体样品中MDA含量计算公式：
MDA浓度(μmol/L)=(A _测定-A _空白)/(A _标准-A _空白)×10
简易快速细胞、组织样品中MDA含量计算公式：
MDA浓度(μmol/g)=(A _测定-A _空白)/(A _标准-A _空白)×10/蛋白质浓度(mg/ml)
A _测定=测定孔的吸光度
A _标准=标准孔的吸光度
A _空白=空白孔的吸光度
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